最强的生物化学笔记(5)

蛋白质的溶解度取决于氨基酸侧链基团的极性，离子化基团的数量。 1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 A.蛋白质表面极性基团形成水化膜

B.非等电状态时，同种电荷的互相排斥 2. 沉淀蛋白质的方法

A.盐析法

高浓度的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 B.有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数

C.重金属盐沉淀

与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）生成不溶性沉淀 D. 生物碱和某些酸类沉淀法

pH 小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成沉淀 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸

E. 加热变性沉淀：加热变性沉淀通常不可逆

三、蛋白质的变性

理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大。 1. 变性的因素

强酸、强碱；有机溶剂；去污剂；还原剂（β-硫基乙醇）；盐析、盐溶；重金属离子；温 度；机械力（搅拌、研磨） 2. 蛋白质变性后的现象 ①结晶及生物活性丧失

②疏水侧链基团外露，分子结构伸展松散

③理化性质改变，溶解度降低，沉淀，粘度增加

④生物化学性质改变，易被蛋白酶水解 实际应用

A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温B.提取活性蛋白质时防止蛋白质变性 3. 可逆变性与不可逆变性

二级、三级或四级结构遭受被破坏即为变性。

三级（或四级）结构被破坏时，往往引起可逆变性。

二级及三级（或四级）结构一并破坏时，往往引起不可逆变性。 四、分离纯化蛋白质的主要方法

目的：蛋白与非蛋白分开，蛋白质之间分开

1.溶解度差异：PEG 沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法

2.热稳定性差异：热处理沉淀法；铜锌SOD（65℃、15 分钟、稳定） 3. 电荷性质差异离子交换层析法、电泳法 4. 分子大小和形状差异

凝胶过滤、超滤法、透析法、离心法

5. 与配体亲和力的差异

亲和层析法（affinity chromatography）：目的蛋白与一种配基特异结合。配基是能与目的

蛋白结合的原子团和分子。酶与底物、激素与受体蛋白、抗原与抗体。

五蛋白质的分离方法

1.蛋白质的抽提 材料预处理及细胞破碎（机械、渗透、反复冻融、超声波、酶法） 粗分离（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、超滤、吸附） 细分离（见下分离纯化方法）

电泳法 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳

等电聚焦 双向电泳 脉冲电泳

2?蛋白质分离

纯化主要方法 层析法 凝胶过滤层析

离子交换层析 亲和层析 离心法 差速离心

速率区带离心

紫外吸收法：280nm处有最大吸收

280nm-260nm吸收差法：蛋白质浓度（g/ml）=1.45OD280-0.74OD260

凯氏定氮：

福林—酚法（Lowry法）：Pr Pr-铜复合物 鉬蓝或钨蓝 3?蛋白质含量 G-250(红棕色)

测定 考马斯亮蓝染料结合法：Pr(10-100μg/ml) -- 蓝色复合物（正比）--595nm Cu2+ 双缩脲法：双缩脲 OH

4. 色谱与氨基酸的分析分离 （1）色谱的分类：

-

紫色复合物（正比）灵敏度差可用来快速鉴定

按流动相可分为气相、液相、超临界色谱等； 按介质可分为纸层析、薄层层析、柱层析等；

按分离机制可分为吸附层析、分配层析、分子筛层析等 （2）.色谱的应用

可用于分离、制备、纯度鉴定等。

定性可通过保留值、内标、标准曲线等方法，定量一般用标准曲线法。 氨基酸的分析分离是测定蛋白质结构的基础。在分配层析和离子交换层析法开始应用于氨基酸成分分析之后，蛋白质结构的研究才取得了显著的成就。现在这些方法已自动化。 氨基酸从强酸型离子交换柱的洗脱顺序如下：

Asp,Thr,Ser,Glu,Pro,Gly,Ala,Cys,Val,Met,Ile,Leu,Tyr,Phe,Lys,His,(NH3),Arg

【常考考点】以题巧记

1、指出用电泳技术分离下列物质，pH是多少时最合适？

（1）血清清蛋白（pI=4.9）和血红蛋白（pI=6.8） （2）肌红蛋白（pI=7.0）和胰凝乳蛋白质（pI=9.5）

（3）卵清蛋白（pI=4.6） 、脲酶（pI=5.0） 解析：电泳分离技术是根据物质带电荷的多少达到分离的目的。待分离的物质所带电荷的差异越大分离效果越好，所以应取两者pI的中间值，带正电荷的粒子电泳时向负极移动，

带负电荷的粒子电泳时向正极移动。

2在分离范围为5，000-400，000的凝胶过滤柱上分离蛋白质，指出肌红蛋白、过氧化氢酶、 胞色素C、胰凝乳蛋白酶原、肌球蛋白、血清蛋白被洗脱下来的先后顺序。

解析：凝胶过滤是根据分子大小从混合物中分离蛋白质的最有效的方法之一，所以又称分子筛。大分子蛋白质比小分子蛋白质先被洗脱下来。根据待分离物质的分子大小，可知被洗脱下来的先后顺序为：肌球蛋白、过氧化氢酶、血清蛋白、胰凝乳蛋白酶原、肌红蛋白、细胞色素C。

3、根据下述材料，回答下列问题：

材料一 早在300年前，人们已经注意到在绵羊和山羊身上患的“羊搔痒症”。其症状表现为：丧失协调性，站立不稳、烦燥不安、奇痒难熬，直至瘫痪死亡。20世纪60年代，英国生物学家阿尔卑斯用射线破坏DNA和RNA后，其组织仍具感染性。

材料二 1996年春天，“疯牛病”（其症状与“羊搔痒症”相似）在英国乃至全世界引起了一场空前的恐慌，甚至引发了政治与经济的动荡，一时间人们“谈牛色变”。

材料三 1997年，诺贝尔生理学奖授予美国生物化学家斯坦利2普鲁辛纳，因为他在研究“疯牛病”的过程中发现了一种新型的生物——朊病毒（Piron）。朊病毒对某些化学试剂，如甲醛、羟胺、核酸酶类等表现出强抗性；但对蛋白酶类、尿素、苯酚、氯仿等不具抗性。

（1）一般的病毒都具有由 构成的外壳和由 构成的核心。

（2）从上述材料可知，朊病毒很可能仅由一类物质构成，这类物质应是 ；你的判断依据是：

（3）请你谈谈此项发现在理论上和实践上的重大意义？

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