医学分子生物学复习思考题及答案(12)

（2）、PCR 扩增突变基因，合成针对突变点的探针，将它与扩增产物杂交，杂交阳性说明有相应的基因突变存在。

11、什么是RT—PCR？什么是原位PCR？

答：（一）RT—PCR（逆转录PCR）

RT—PCR（reverse transcription PCR）是将 RNA 逆转录反应与 PCR反应联合应用的一种技术。首先，以RNA为模板，经逆转录得到cDNA，再以cDNA为模板，经 PCR 扩增目的基因。目前，RT—PCR是真核细胞mRNA进行定性及半定量分析的有效方法。

（二）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是在组织切片或细胞涂片的细胞内进行PCR。对扩增产物用特异性探针与之进行原位核酸杂交，从而检测出待测DNA或RNA的存在以及存在的部位。虽然这种方法的灵敏度不高，但它是目的基因定位的一个最佳方法。

12、非探针类实时荧光定量PCR的基本原理是什么？

答：原理：在常规PCR时，加入特殊的荧光染料SYBR Green，这种染料能与双链DNA的小沟区域结合。当这种染料未与DNA结合处于游离状态时，荧光信号强度极低。一旦它与双链DNA通过小沟区域结合后，荧光信号大大增强，约为游离时的1000倍。PCR扩增产物双链DNA越多，荧光信号就越强，下一轮循环变性时，双链DNA能形成单链，荧光近消失，待这一轮循环结束，产生双链DNA时，又出现大量荧光。这样，实时记录了荧光量即DNA量。

13、探针类实时荧光定量PCR有哪三种？试述TaqMan探针法的基本原理。

答：根据使用探针不同又分为：TagMan探针法，分子信标探针法及荧光共振能量转移探针法。

TaqMan探针法基本原理：

①在常规PCR反应体系中，加入一条能与模板DNA特异结合的TagMan探针，这个探针的5｀端标记有荧光报告基团R（reporter， R），3｀端标记有荧光淬灭基团Q（quencher，Q）。

②当探针上报告基团R及淬灭基团Q同时存在时，无荧光信号释放。当R基团与Q基团分离时，R基团便能产生荧光信号。

③PCR扩增时，DNA链合必延长，当遇到与模板DNA结合的探针时，Taq DNApol发挥5’ 3’核酸外切酶活性，将探针5‘ 端的R基团水解下来，产生荧光。由荧光检测系统收集。探针余下部分，继续由Taq DNApol 水解切除。PCR扩增继续向前，直至此循环结束。在下一轮循环，产生上述同样过程，收集荧光信号。 ④这样，TagMan 探针就在每一轮PCR扩增时，就实时测定PCR产物的量（荧光量）。

14、什么是基因组DNA文库？什么是cDNA文库？

答：从细胞中提取总基因组DNA，用相应的限制性核酸内切酶酶切，得到大小不同的许多各种基因片段，将这些基因片段分别与相应的基因载体（如噬菌体载体）连接重组。于是形成各种重组体，将所有这些重组体转导入合适的受体细胞中（如大肠杆菌），对受体细胞进行培养扩增，从而获得含有某种生物体全部基因片段的重组DNA克隆群体，它可以涵盖该种生物基因组的全部基因信箱，称之为基因组DNA文库。

从细胞（液）中提取mDNA，通过转录得到相应的各种cDNA 。然后将这些cDNA分别与相应的载体（质粒载体或噬菌体载体）连接，得到各种重组cDNA。将所

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