医学分子生物学复习思考题及答案(16)

目的DNA及载体DNA两端均为平端时，由DNA连接酶催化将二者连接起来

3、粘—平末端连接法

目的DNA两端与载体DNA两端连接时，其中的一端为粘端连接，另一端为平端连接，称粘—平末端连接法。

11、什么是感受态态细胞？重组DNA转入宿主细胞的方法有哪些？

答：感受态细胞：用化学物理方法处理宿主细胞，使之成为接受外源DNA的最佳状态，称之为感受态细胞。

重组DNA转入宿主细胞的方法有：

1、转化：重组质粒转入大肠杆菌称转化。重组质粒直接导入酵母细胞也称转化。使用方法有氯化钙化学诱导法，电穿孔法等。

2、转染：外源DNA直接导入真核细胞（酵母细胞除外）的过程称转染。使用方法有磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法、显微注射法、电穿孔法等。

3、感染：以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA，再包装成病毒颗粒，通过感染的方式将重组DNA转入细菌体内或哺乳动物细胞。

12、借助载体上遗传标志进行筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？

答：（1）利用抗生素抗性标志筛选：如用质粒作为载体构建重组体，质粒上有AmpR（抗氨苄青霉素基因），当这种重组DNA（体）导入细胞后，这种细胞对Amp 就有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就能生长。而导入不成功的细胞，对Amp没有抵抗性，在含有Amp 的培养基上就不能生长。

（2）利用基因插入失活法筛选：质粒PBR322中含有AmpR 及 TetR(抗四环素基因)。在TetR中，含有限制性内切酶 BamHI 的酶切位点，当用这个RE酶切 PBR322 及目的基因，使目的基因插入到 TetR中，于是TetR 失活。结果，重组体转化成功的细胞在含有Amp的培养基上能生长，而在含有Tet的培养基上则不能生长。

（3）利用基因插入表达法进行筛选：质粒PTR262构建重组时，PTR262中含有CI基因，其表达的阻遏蛋白能抑制TetR的表达。CI基因中有RE酶切位点，当插入目的基因构建重组体质，CI基因失活，不能表达出阻遏蛋白。于是TetR去阻遏， TetR表达。结果，转化成功的细胞，在含有Tet的培养基上就能生长。

（4）利用标志补救筛选

标志补救（marker rescue）是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时，其表达产物能互补宿主细胞的相应缺陷，从而使阳性重组细胞能再相应的培养基中存活。

（5）利用噬菌体的包装特性进行筛选

噬菌载体与目的外源DNA重组时，其总长度应为噬菌体野生型长度的75%—105%时，才能包装成有活性的噬菌体颗粒，于是在培养基上呈现出清晰的噬菌体斑。不含外源目的DNA的噬菌体载体，由于长度太少，不能包装成有活性的噬菌体颗粒，培养基上就看不见噬菌斑。

13、序列特异性筛选阳性重组细胞的方法有哪些？试述之？

答：（1）RE酶切法：从克隆细胞中提取重组DNA，经合适的RE酶切得到大少不同片段，经琼脂糖电泳分离各片段，根据各片段位置不同而比较大小（bp）与标准样比较即可做出筛选。

（2）PCR法：从重组细胞中提取DNA，用特异性引物扩增目的DNA片段，经电泳分离，并与标准目的DNA比较，即可做出筛选。

（3）核酸杂交法：常用的是菌落或噬菌斑原位杂交，将克隆的菌落或噬菌斑印压至硝酸纤维膜（NC膜）上，然后将细菌裂解（酶裂解）释放出DNA，并吸附固

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