医学分子生物学复习思考题及答案(15)

因等。

真核表达载体根据宿主细胞不同，又分为：酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体等。

8、重组DNA技术包括哪些基本过程？如何获得目的基因？

答：一个完整的重组DNA过程包括五大步骤，简称为：

分、选、接、转、筛

（一）目的基因的分离获得—分

１、人工化学合成法：用DNA自动合成仪合成，主要用于小片段DNA合成，若基因片段太长，先分段合成后再连接成长片段基因。

2、从基因文库中获得：从基因组文库及cDNA文库中，采用核酸杂交等方法获取目的基因。

3、PCR法：是目前最常用的方法，根据目的基因两端的碱基顺序合成一对引物，经PCR扩增获得目的基因。

4、其它方法：如酵母杂交法系统克隆得与蛋白质特异相互作用的基因等。

9、如何选择基因载体？

答：载体的选择与构建—选

DNA克隆目的主要有二个：

① 获得目的DNA片段的大量拷贝

② 获得目的DNA片段的表达产物蛋白质。

针对目的①应选用克隆载体。针对目的②

应选用表达载体

此外，还要根据目的DNA片段大小，受体细胞的种类、来源等对载体进行选择。有的克隆过程要求载体上有多克隆位点（MCS）

10、目的DNA与基因载体的连接方法有哪些？试述之

答：1、粘端连接法（粘性末端链接法）

（1）单一相同粘端链接法：用同一种限制性核酸内切酶（RE）切割目的DNA及载体DNA，产生完全相同的单链互补粘性末端，然后由连接酶催化将目的DNA与载体DNA连接起来。

（2）不同粘端连接法：用两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA。结果，目的DNA及载体DNA的两端就可产生两个不同的粘端，于是目的DNA就能定向的插入载体中。这种使目的DNA按特定方向插入载体的克隆方法。称之为定向克隆（directed cloning）.

（3）其它粘端连接法

① 人工接头法：人工合成含有某种RE酶切位点的双链寡核苷酸称之为接头（adaptor），然后将此接头与目的DNA连接起来。用同一种RE酶切带接头的目的DNA及载体DNA，产生单一相同粘端，再由连接酶催化将二者连接。

②同聚物尾法：在末端转移酶催化下，将一种核苷酸（如dc）逐一连接在目的DNA的3’端，形成同聚物尾。用同样方法将另一互补核苷酸（如dG）逐一连接在载体DNA的3’端，形成互补的同聚物尾，于是粘端连接法将二者连接起来。 ③ PCR法：针对目的DNA两端设计合成一对特异性引物，在每条引物的5’端分别连接上不同的RE的酶切位点。当用这种引物以目的DNA为模板进行PCR扩增时，得到的扩增物目的DNA的两端就分别含有不同RE的酶切位点。用这两种不同的RE酶切目的DNA及载体DNA，于是，目的DNA就能定向插入到载体DNA中。

2、平端连接法

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